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雙縮脲法蛋白質含量測定試劑盒說明書

發布時間:2023/4/4點擊次數:555

雙縮脲法蛋白質含量測定試劑盒說明書

                                                微量法100T/96S

 

    意:正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定,確保蛋白濃度在110mg/ml范圍內。

測定意義:

樣品可溶性蛋白質含量常常用于酶活性計算。此外,可溶性蛋白質含量也用于食品等質量分析。

 

測定原理:

強堿性溶液中,雙縮脲與CuSO4形成紫色絡合物;紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比,而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關,故可用來測定蛋白質含量。該方法測定范圍為1~10mg蛋白質,適用于蛋白質濃度高的樣品,尤其是動物材料。

 

自備儀器和用品:

離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、移液器和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體20mL×1瓶,4℃保存。

標準品:液體1mL×1瓶,5 mg/mL4℃保存。

 

樣品中可溶性蛋白質提取:

1.        液體樣品:澄清無色液體樣品可以直接測定。

2.        組織樣品:按照組織質量(g:提取液體(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液自備,根據需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水)

冰浴勻漿,8000g4離心10min,取上清,即待測液。(動物樣品常常需要稀釋)

3.        細菌、真菌:按照細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g4,離心10min,取上清置于冰上待測。

 

測定操作:

1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min,調節波長到540 nm,蒸餾水調零。

2. 空白管:0.5mL EP管,加入40μL蒸餾水,200μL試劑一,混勻后室溫靜置15 min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,540nm比色,記為A空白管。

3. 標準管:0.5mL EP管,加入40μL標準液,200μL試劑一,混勻后室溫靜置15 min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,540 nm比色,記為A標準管。

4. 測定管:0.5mL EP管,加入40μL待測液,200μL試劑一,混勻后室溫靜置15 min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,540nm比色,記為A測定管。

注意:空白管和標準管只需測定一次。

 

樣品中蛋白質濃度計算公式:

C待測(mg/mL= C標準管×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)

              

         =5×(A測定管-A空白管)÷(A標準管-A空白管)

 

注意事項:

1.樣品蛋白濃度須在110mg/ml范圍內,低于1mg/ml不能用此法,高于10mg/ml須做相應稀釋。因此測定前用12個樣做預實驗,確保蛋白濃度在110mg/ml范圍內。

2.待測樣品蛋白提取可用生理鹽水、雙蒸水或不含蛋白的PBS提取。該法受硫酸銨、Tris緩沖液干擾,提取液中應不含這些物質;否則改用BCA蛋白質含量測定試劑盒。

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