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谷氨酰胺酶(glutaminase, GLS) 活性測定試劑盒說明書

發布時間:2023/4/6點擊次數:566

谷氨酰胺酶(glutaminase, GLS) 活性測定試劑盒說明書

                                        微量法100/96

   意:正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:

GLSEC 3.5.1.1是酰胺基水解酶,催化天冬酰胺水解成谷氨酸和氨,在氮素代謝中具有重要調控作用,尤其是調節游離氨含量和尿素代謝。

測定原理:

GLS催化谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨,利用奈氏試劑檢測氨增加的速率,即可計算其酶活性。

需自備儀器和用品:

臺式離心機、酶標儀、96孔板、可調式移液槍、研缽、冰和雙蒸水。

試劑組成和配制:

試劑一×2瓶,60 mL4 ℃保存;

試劑二×1瓶,40 mL4 ℃保存;

試劑三×1瓶,60 mL,常溫保存;

試劑四×1瓶,5 mL,常溫保存;

試劑五×1瓶,3 mL,常溫保存;

試劑六×1瓶,3 mL,常溫避光保存。

粗酶液提取:

1、細菌、細胞或組織樣品的制備:

細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL試劑一),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質量(g):試劑一體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一),進行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

2、血清(漿)樣品:直接檢測。

測定步驟:

1、酶標儀預熱30min以上,調節波長至420nm

2、樣品測定(在EP管中加入下列試劑):

試劑名稱(μL

測定管

對照管

樣本

25


蒸餾水


25

試劑一

100

100

試劑二

400

400

混勻,37℃水浴1 小時

試劑三

525

525

混勻,8000 g25℃離心10 min;取上清液,在96孔板中加入下列試劑

上清液

130

130

試劑四

30

30

試劑五

20

20

試劑六

20

20

混勻,室溫靜置15min420nm處讀取測定管和對照管吸光值,計算ΔA=A測定管-A對照管。對照管只要做一管。

注意:

1、試劑六如出現沉淀,靜置后取上清使用。

2ΔAA測定管-A對照管)若出現負值,可能是酶活性較低,可將反應時間1h延長到2h,相應的在計算公式中除以2

酶活性計算:

標準條件下測定的回歸方程為y = 1.9244x + 0.0057R2 = 0.9983x為標準品濃度μmol/mLy吸光值A

1、血清(漿)GLS活性

單位定義:每mL血清(漿)min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個酶活力單位。GLS(nmol /min /mL) (ΔA-0.0057) ÷1.9244×V反總÷V÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)

2、組織、細菌或細胞GLS活性

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位定義:每mg蛋白質每min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個酶活力單位。

GLS(nmol /min /mg prot) (ΔA-0.0057) ÷1.9244×V反總÷(V×Cpr)÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057Cpr

2)按樣本鮮重計算:

單位定義:每g組織min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個酶活力單位。

GLS(nmol/min /g 鮮重)(ΔA-0.0057)÷1.9244×V反總÷(W×V÷V樣總T×1000=363.7×(ΔA -0.0057W

3)按細菌或細胞密度計算

單位定義:每1萬個細菌或細胞min催化谷氨酰胺生成1nmol 氨定義為一個酶活力單位。GLS(nmol/min/104 cell)(ΔA-0.0057)÷1.9244×V反總÷(500×V÷V樣總) ÷T ×1000       =0.7274×(ΔA -0.0057)

V樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應時間,60minV反總:反應體系總體積,1.05mLV樣:加入反應體系中樣本體積,0.025mLCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g500:細菌或細胞總數,500; 1000μmolnmol換算系數。


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