脂氧合酶（LOX）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                         微量法100T/48S

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

LOX廣泛存在于動(dòng)植物組織中，催化不飽和脂肪酸氧化反應(yīng)，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化。在生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、成熟衰老及逆境脅迫過(guò)程中具有重要作用。

測(cè)定原理：

LOX催化亞油酸氧化，氧化產(chǎn)物在280nm處有特征吸收峰；測(cè)定280nm吸光度增加速率，來(lái)計(jì)算LOX活性。

自備儀器和用品：

研缽、冰、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體20mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1支，4℃保存。

粗酶液提取：

按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。16000g，4℃離心20min，取上清置冰上待測(cè)。

測(cè)定：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到280 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 在試劑三中加入10mL試劑二（振蕩混勻1min），在30℃水浴中預(yù)熱10 min以上。用不完的試劑4℃保存。

3. 對(duì)照管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL樣本和180μL試劑二，30℃反應(yīng)30min后，記錄A對(duì)照。

4. 測(cè)定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL樣本和180μL試劑三，30℃反應(yīng)30min后，記錄A測(cè)定。

5. ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照

LOX活性計(jì)算：

（1）按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘催化吸光值變化0.01個(gè)單位為1個(gè)酶活單位。

LOX (U/mg prot) =ΔA×V反總÷(Cpr×V樣)÷T×100

= 33.33×ΔA÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中每克組織每分鐘催化吸光值變化0.01個(gè)單位為1個(gè)酶活單位。

LOX (U/g 鮮重) =ΔA×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T×100

= 33.33×ΔA÷W

Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，需另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；V反總：反應(yīng)體系總體積，200μL=0.2mL；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02mL；W ：樣品質(zhì)量，g；V樣總：上清液總體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。