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酪氨酸解氨酶(Tyrosine ammonilyase,TAL)試劑盒說明書

發布時間:2023/11/8點擊次數:677

酪氨酸解氨酶(Tyrosine ammonilyaseTAL)試劑盒說明書

                                          微量法100/48

 

 

   意 :正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:                           

TAL廣泛存在于植物和微生物中,是苯丙氨酸代謝途徑的關鍵酶之一。TAL能夠躍過肉桂酸-4-羥基化酶(C4H)直接將酪氨酸轉化為香豆酸,香豆酸可進一步生成白藜蘆醇、柚皮素等具有抗氧化、抗衰老作用的苯丙素類天然產物。

 

測定原理:

TAL能夠分解酪氨酸產生香豆酸,使反應溶液333nm下的吸光度隨反應時間而上升,根據吸光度的變化率可計算出TAL活性。

 

需自備的儀器和用品:

酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、96孔板(UV板)、研缽、冰和蒸餾水

 

試劑組成和配制:

提取液:液體100mL×1瓶,4保存;

試劑一:液體50mL×1瓶,4保存;

試劑二:粉劑×2瓶,4保存;

試劑三:液體5mL×1瓶,4保存;

 

粗酶液提取:

1、細菌、細胞或組織樣品的制備:

細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4離心10min,取上清,置冰上待測。

2、血清(漿)果汁等液體樣品:直接檢測。

 

測定步驟:

1、  酶標儀預熱30min以上,調節波長至333nm

2、   準備96UV板一塊(非普通酶標板,普通酶標板只能透過可見光,不能透過紫外光,檢測波長小于340nm務必使用UV板)。

3、   試劑二的配置:臨用前在試劑二瓶中加入10mL試劑一充分溶解待用(用不完的試劑4保存一周,注意現配現用),37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴10min以上。

4、在EP管中依次加入如下試劑

試劑名稱(μL

測定管

對照管

樣本上清

40

40

試劑一


360

試劑二

360


充分混勻,40℃保溫60min

試劑三

20

20

混勻,10000g 4℃離心5min,取200μL上清至96UV板,333nm下測定吸光值A測定與A對照,ΔA=A測定-A對照

 

TAL活性計算:

1、血清(漿)或果汁TAL活性

單位的定義:每分鐘每mL血清(漿)或果汁在每mL反應體系中使333nm處吸光值變化

0.005為一個酶活力單位。

TALU/mL=ΔA×V反總÷( V÷V樣總)÷0.005÷T =35×ΔA

2、組織、細菌或細胞TAL活性

1)按樣本蛋白濃度計算:

單位定義:每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應體系中使333nm處吸光值變化0.005為一個

酶活力單位。

TALU/mg prot=ΔA×V反總÷V×Cpr÷0.005÷T =35×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2)按樣本鮮重計算:

單位定義:每分鐘每g組織在每mL反應體系中使333nm處吸光值變化0.005為一個

酶活力單位。

TALU/g 鮮重=ΔA×V反總÷(W× V÷V樣總)÷0.005÷T =35×ΔA÷W

3)按細菌或細胞密度計算:

單位定義:每分鐘每1萬個細菌或細胞在每mL反應體系中使333nm處吸光值變化0.005為一個酶活力單位。

TALU/104 cell=ΔA×V反總÷(500×V÷V樣總)÷0.005÷T =0.07×ΔA

V反總:反應體系總體積,0.42mLV樣:加入樣本體積,0.04mLV樣總:加入提取液體積,1 mLT:反應時間,60 minCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mLW:樣本質量,g500:細胞或細菌總數,500萬。

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